Effsect of Casein Phosphopeptides on the Bone Mineral Density in Aged Ovariectomized Rat

冯凤琴¹，王博诚²，许时婴³，王璋³，金坚²

（¹浙江大学食品科学与营养系，杭州 310029；²江苏源自医学研究所，无锡 214036；³江南大学食品学院，无锡 214036）

FENG Fengqin¹,WANG Bo-cheng²,XU Shi-ying³,WANG Zhang³,JIN Jian²

(¹Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310029;

²Jiangsu Institute of Nuclear Medicine,Wixi 214036;

³School of Food Science,Wuxi University of Light Industry,Wuxi 214036,China)

酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides,简称CPP)是以牛乳酪蛋白为原料,经单一酶或复合酶水解,再经分离纯化而得到的含有成簇的磷酸丝氨酰基的多肽。Mykkanen等在正常鸡和佝偻病鸡上进行了钙吸收和利用试验，结果表明，CPP能促进钙的吸收和利用^[1]。Sato等也报道，CPP可促进核素标记的钙在大鼠股骨中沉积^[2]。Tsuchita等证明，CPP可显著抑制切除卵巢的老年雌性大鼠股骨的骨密度降低^[3]。张亚非等也通过大鼠试验证明，无论在低钙饲料还是基础饲料中，添加一定量的CPP后，可显著增加断乳大鼠对钙的吸收率和储留率，但未能证明钙的利用率有显著变化^[4]。本研究组用复合酶-胰酶水解酪蛋白，用选择沉淀法从酪蛋白的酶解液中分离CPP，得到了CPP产品，并分析测定了其主要组分的分子结构^[5]和体外功能指标^[6]。本研究将通过大鼠试验研究该产品对切除卵巢后老龄雌性大鼠骨密度的影响及对骨质疏松的预防作用。

1. 材料及方法

1.1CPP及大鼠饲料

CPP是用选择沉淀法从酪蛋白的胰酶水解液中分离得到，其中总氮、钙及磷的含量分别为9.07%、6.00%和2.94%，水分含量为17.0%。大鼠基础饲料的主要组成（%）为：小麦粉30、豆饼粉30、玉米粉30、鱼粉5.0、骨粉1.5、脱脂奶粉1.6、鱼肝油1.0、食盐0.5.试验组饲料由基础饲料添加8%的CPP制成。

1.2 试验大鼠卵巢切除及饲养

试验大鼠为SD品系，11m龄时自浙江实验动物中心购入。18只大鼠随机分成3组，每只鼠分别标记，单笼饲养。饲养室温度（20~25）℃，试验大鼠自由进食基础饲料和自来水。至13m龄时，对其中两组实施卵巢切除术，另一组施行伪手术（造成同样的创口，但不切除卵巢）。手术前用65mg/kg bw的硫喷妥钠对大鼠施行麻醉，切下的卵巢分别放入装有福尔马林溶液的小瓶，送病理科检验卵巢是否切除完整。

手术后恢复饲养1m，之后将一组切除卵巢的大鼠作为对照1组(Sham），饲喂基础饲料。一次给入一星期的饲料（200~220g），下次补充饲料前对所剩饲料称重，精确记录每只鼠的饲料消耗量。

1.3 骨密度（BMD）和骨矿物质含量（BMC）的测定、

测定BMD和BMC之前，先称重，按55mg/kg bw硫喷妥钠的剂量对大鼠实施麻醉。麻醉后将大鼠摆成匍匐状，四肢自然伸展，用橡皮膏固定于纸上，在DEXA双能X-线骨密度仪（美国，Norland公司）上，对鼠全身进行扫描，扫描结束后，框取鼠全身，鼠头部或腿部，用骨密度仪上配置的数据处理系统计算全身或鼠体不同部位的BMD和BMC。

1.4 磁性激素的测定

在对大鼠施行卵巢切除手术之前和手术后1m时，分别从每只大鼠尾部采集0.5ml血液，用放免试剂盒测定血液中雌二醇（E2）、黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的含量。

1.5 统计分析

实验结果用表示，各组间的差异显著性分析用DPS数据处理软件，采用Bonferroni检验法分析。

2. 结果

2.1 磁性激素的测定及卵巢病理检验结果

卵巢在卵成熟前分泌雌二醇，卵巢切除后血液中雌二醇水平下降，切除卵巢后，黄体生成素和促卵泡激素在血液中的含量都将上升^[7]。从测定手术前后血液中三种雌性激素含量的变化，可以确证卵巢切除术的效果。保证最终试验结果的可靠性。由江苏原子医学研究所附属江原医院检验科完成的三种雌性激素的测定，结果见表1，结合病理科出具的检验报告可以肯定，大量的卵巢均被完整切除。

Table 1 Hormines of rats before and after ovariectomy*

Before：before ovariectomy；After： after ovariectomy；* the data is the average of six rats

2.2 大鼠体重的变化

试验期间三组大鼠的体重变化不大，至试验结束时，各组大鼠的体重略有上升。T组大鼠体重一直呈上升趋势，Sham 1 和Sham 2组手术后体重一度呈下降趋势，术后2m时，体重又开始慢慢回升。

2.3 大鼠的骨密度（BMD）和骨矿物质含量（BMC）

在对大鼠施行手术之后4.5m，也即用添加CPP的饲料饲喂大鼠3.5m之后，测定了其BMD和BMC。大鼠全身BMD和BMC测定结果见表2。手术后4.5m时，Sham 1组和Sham 2组的BMD和BMC几乎等同，CPP组的BMD和BMC均比对照组高，统计分析表明，CPP组与Sham 1及Sham 2的差异均未达到显著水平（P>0.05）。

Table 2 BMD and BMC of the whole body of rats ()

研究表明，骨质疏松症常按以下顺序发生骨骼损耗：第一步，颌骨、牙槽骨发生骨损，引起支持牙齿的力量下降，造成牙龈松动继而损坏而掉牙；第二步，脊椎骨骨骼损耗，导致难于愈合的压迫性骨折，使病人睡年龄的增长而身高降低；第三步，长骨骨损发生。因为要在颌骨和脊椎骨有骨损时，长骨的骨质才开始丢失，因此早期的骨质疏松症用X射线是难于确诊的，但通过X射线照射颌骨能迅速地诊断早期的骨质疏松症^[8]。鉴于此，我们对大鼠的头部及左、右腿的BMD和BMC分别进行了就算，结果见表3.

Table 2 BMD and BMC of heads and legs of rats ()

Note:data in the same column not sharing same superscript are significantly different(p<0.05)

从表3中看出，CPP组头部的BMD明显高于Sham 1组(p<0.05)，但CPP组头部的BMD与Sham 2之间及CPP组头部的BMC与两对照之间的差异均未达到显著水平。而大鼠腿部的BMD和BMC则更未表现出差异。

3. 讨论

据Hodgkinsin^[7]报道，单纯性卵巢切除（不辅以其它引发骨质疏松的因素），手术组骨量减少至比对照组显著降低（显著水平为p<0.05）需30w，即7m多。Kalu等^[9]也报道，切除卵巢的老龄大鼠，6m后，股骨和腰椎的骨密度才能显著降低。为了模拟摄取正常膳食的绝经妇女，本研究采用单纯性卵巢切除来诱发骨质疏松，由于时间及其它方面条件的限制，本试验未能继续至单纯性卵巢切除诱使骨密度显著降低所需的时间期限（7m左右）。因此，除了CPP处理组与切除卵巢的对照组（Sham 1）的头部骨密度差异达到显著水平外，大鼠全身及腿部的骨密度及骨矿物质含量与Sham 之间及Sham 1和Sham 2组之间骨密度的差异均未达到显著水平。但由于动物骨损的发生有前述特定的规律，第一步是发生在头部，之后才是脊椎和长骨，因此在头部已表现出明显的骨损后，将试验持续进行下去，腿部及全身表现明显骨损的可能性很大，若能辅以低钙饲料，则将会加快这一进程。就目前取得的结果分析，已可以肯定CPP对延缓切除卵巢的老龄磁性大鼠骨质丢失有一定效果。

关键词：酪蛋白磷酸肽；老龄大鼠；骨密度；骨质疏松

Key words: casein phosphopeptides(CPP); aged rats; bone mineral density(BMD); osteoporosis

参考文献

[1] Mykkanen HM, Wasserman RH.Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks[J]. J Nut.1980,110;2141-2148.

[2] Sato R,Noguchi T,Natio H.Casein phosphopeptide enhance calcium absorption from the ligated segment of rat small intestine[J].J Nutr Sci Vitaminol,1986,32:67-76.

[3] Truchita H,Goto T,Shimizu T,et al,Dietary casein phosphopeptides prevent bone loss in aged ovariectomized rats[J].J Nutr Sci,1996,126:86-93.

[4] 张亚非，周羽并，吴凤兰，等，酪蛋白磷酸肽（CPP）对大鼠钙吸收利用的影响[J].营养学报，1994，16:73-77

[5] 冯凤琴，王博诚，倪莉，等，酪蛋白磷酸肽分子结构的鉴定[J].无锡轻大学学报，1999,18:33-37.

[6] 冯凤琴，许时婴，王璋，低N/P酪蛋白磷酸肽的生产制备及功能性质的研究[J].中国食品学报，1998,2:1-5

[7] Hodgkinson A,Aaron JE,Horsman A,et al.Effect of oophorectomy and calcium deprivation in bone mass in the rat[J].Clin Sci Mol Med,1978,54:439-446.

[8] [美】AH恩斯明格.ME恩斯明格，JE康兰德，等，疾病与饮食[M].北京：农业出版社，1989.176-177.

[9] Kalu DK,Liu CC,Hardin R,et al.The afed rat model of ovarian hormone deficiency bone loss[J].Endocrinology,1989,124:7-16.